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May 21, 2023

Évaluation de la synthèse de polyhydroxyalcanoate (PHA) par Pichia sp. Levure TSLS24 isolée au Vietnam

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 3137 (2023) Citer cet article

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Suite à l'inquiétude croissante suscitée par les problèmes environnementaux causés par les plastiques fossiles conventionnels et l'épuisement des ressources en pétrole brut, les polyhydroxyalcanoates (PHA) suscitent un grand intérêt auprès des scientifiques et du marché des polymères biodégradables en raison de leurs propriétés exceptionnelles, notamment une biodégradabilité élevée dans diverses conditions et une flexibilité de traitement. De nombreux micro-organismes synthétisant des polyhydroxyalcanoates, y compris des bactéries normales et halophiles, ainsi que des algues, ont été étudiés pour leurs performances dans la production de polyhydroxyalcanoates. Cependant, à notre connaissance, il existe encore peu d'études sur la levure marine productrice de PHA. Dans la présente étude, une souche de levure halophile isolée de l'île de Spratly au Vietnam a été étudiée pour son potentiel dans la biosynthèse des polyhydroxyalcanoates en cultivant la levure dans un milieu de gélose marine Zobell (ZMA) contenant un colorant rouge du Nil. La souche a été identifiée par analyse d'ADNr 26S comme étant Pichia kudriavzevii TSLS24 et enregistrée dans la base de données Genbank sous le code OL757724. La quantité de polyhydroxyalcanoates synthétisés a été quantifiée en mesurant les matériaux intracellulaires (prédits comme poly (3-hydroxybutyrate) -PHB) par méthode gravimétrique et ensuite confirmée par analyse spectroscopique infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et spectroscopique par résonance magnétique nucléaire (RMN). Dans des conditions de croissance optimales de 35 °C et pH 7 avec supplémentation en glucose et extrait de levure à 20 et 10 gL-1, la souche isolée a atteint une teneur et une concentration en poly(3-hydroxybutyrate) de 43,4 % et 1,8 gL-1 après 7 jours de culture. Le poly(3-hydroxybutyrate) produit a démontré une excellente biodégradabilité avec un taux de dégradation de 28% après 28 jours d'incubation en eau de mer.

Les plastiques biodégradables sont des produits en plastique qui peuvent être dégradés par des organismes vivants tels que les levures, les champignons, les bactéries, les actinomycètes et autres sous certaines conditions lorsqu'ils sont rejetés dans les environnements naturels. La demande de plastiques biodégradables augmente actuellement en raison de leur capacité prometteuse à atténuer les problèmes de pollution causés par les plastiques pétroliers conventionnels. Par conséquent, de nombreuses études sur les bioplastiques, y compris l'acide polylactique (PLA) et les polyhydroxyalcanoates (PHA), ont été rapportées. Parmi les différents types de bioplastiques, les PHA peuvent être biologiquement et synthétisés et complètement dégradés par des micro-organismes même en condition saline comme dans l'eau de mer1. Outre sa biodégradabilité et ses propriétés compostables, les PHA ont un potentiel prometteur de production à l'échelle industrielle car ils peuvent être facilement convertis en différentes formes avec les caractéristiques souhaitées en raison de leur grande variabilité de structure2. Ils ont démontré des potentiels prometteurs dans les applications médicales et la production d'adhésifs, de films, de produits moulés, de revêtements de papier, d'emballages, de tissus non tissés et d'additifs de performance3.

Dans la nature, les PHA sont principalement accumulés à l'intérieur des micro-organismes sous forme de particules insolubles dans le cytoplasme. Suite au déséquilibre des nutriments dû à un excédent de sources de carbone ou à une carence en sources de nutriments, telles que l'azote, le phosphore, le soufre ou même l'oxygène, des PHA de haut poids moléculaire (contenant 103-104 monomères, de taille 0,2-0,5 µm et le nombre de particules est de 5-13 particules/cellule) seraient formés par le système enzymatique intracellulaire par transfert de source de carbone4. Ces particules insolubles servent de stockage de carbone et de réserve d'énergie de la cellule, qui n'influence pas la pression osmotique cellulaire même lorsqu'elle est accumulée à des concentrations élevées1. De nombreuses études ont été menées sur divers types de bactéries productrices de PHA, notamment Pseudomonas, Bacillus, Alcaligenes, Azotobacter, Burkholderia ainsi que des bactéries halophiles telles que Halomonas, Haloferix5,6.

Les levures sont des hôtes potentiels pour la production de polymères PHA car elles peuvent utiliser des substrats peu coûteux comme sources de carbone et elles peuvent être facilement manipulées génétiquement7. De plus, ils ont également une bonne tolérance aux fortes concentrations de sucres et d'acides organiques. Il a été rapporté que les levures Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica et Pichia pastoris sont capables de synthétiser des PHA à chaîne courte (comme le poly(hydroxybutyrate), PHB) et à chaîne moyenne à partir de glucose5,6,8,9,10. En outre, il existe également des études sur des souches de levures génétiquement modifiées pour la production de PHA, notamment Y. lipolytica11,12, S. cerevisiae13,14,15, Rhodotorula minuta RY411, Kebeckera spp.16 et P. pastoris17, bien que les rendements ne soient pas satisfaisants pour une production à grande échelle. Les microbes peuvent accumuler des PHA jusqu'à 90 % de leur poids de cellules sèches et améliorer la production de PHA, et les caractéristiques peuvent être obtenues par des modifications des types de substrats, des stratégies d'alimentation, des conditions de culture et/ou des manipulations génétiques18. Par conséquent, il est nécessaire d'étudier le potentiel des souches de levures halophiles isolées du milieu marin en tant qu'hyperproductrices de PHA.

Pichia est un genre de levure populaire qui peut être trouvé dans le sol, les pelures de fruits et d'autres environnements, qui a la capacité de protéger les fruits contre les dommages et d'inhiber le développement des champignons. Comme Pichia possède une tolérance exceptionnelle à une concentration élevée de glucose et est généralement reconnu comme sûr (GRAS), il a été appliqué dans la fermentation d'éthanol pour la production de bière et de vin. De plus, Pichia a des compétences prometteuses dans la production de PHA et serait capable d'accumuler une teneur élevée en PHA jusqu'à 78,9 % dans des conditions de croissance optimales19. Le but de la présente étude est d'étudier la levure accumulatrice de PHA isolée de l'île de Spratly, au Vietnam, d'identifier la structure du PHA obtenu ; optimiser plusieurs paramètres d'influence pour la production de PHA de levure ainsi que démontrer la dégradabilité du biopolymère produit. Les résultats peuvent donner un indice pour produire du PHA biodégradable à grande échelle pour remplacer le plastique chimique dans un avenir proche au Vietnam.

Des échantillons de sédiments ont été prélevés près de la zone de traitement des déchets d'élevage de l'île de Spratly, au Vietnam, à 8° 38′ 46,58″ N–111° 55′ 21,07″ E.

Les produits chimiques et les milieux pour les expériences provenaient de Sigma et Merck Chemical Co., Allemagne, autrement spécifiquement indiqué.

Un gramme d'échantillon de sédiment a été ajouté à 100 ml d'eau stérilisée et mélangé avant d'être dilué à 10-4 ou 10-5 fois. Le milieu gélosé marin Zobell (ZMA) (Hi-Media) a été utilisé pour isoler les levures halophiles. Le milieu ZMA a été préparé dans de l'eau de mer (90 %, v/v) additionnée de 2 gL-1 de saccharose pour enrichir la croissance de la levure et les plaques de dilution ont été incubées à 30 °C pendant 72 h. Les colonies viables distinctes ont été colorées avec 0,5 mgL-1 de rouge de Nil et observées après 48 h sous lumière ultraviolette à une longueur d'onde de 235 nm. Les colonies de couleur rose ou orange ont été considérées comme des souches de levure productrices de PHA. Ces souches ont été sélectionnées pour être sous-cultivées indépendamment, et leurs stocks de glycérol ont été préparés et conservés à 4 °C pour une utilisation ultérieure20.

Les souches sélectionnées ont été cultivées en milieu liquide ZMA additionné de 10 gL-1 pendant 48h. Ensuite, la culture a été complétée avec 1 ml de 0,5 mgL-1 de rouge de Nil et incubée à 37 °C pendant 1 h. La culture a été centrifugée pour éliminer le surnageant. Le culot de biomasse a été étalé sur des lames et observé au microscope à fluorescence Axioplus (Carl Zeiss, Allemagne) à un grossissement de 40 fois, une longueur d'onde d'excitation de 550 nm et une longueur d'onde d'émission de 570 nm. Les granules de PHA accumulés dans les cellules présentaient une couleur orange10. La morphologie cellulaire a également été observée.

La colonie purifiée a été utilisée pour l'extraction totale de l'ADN par un kit (Chromous Biotech Pvt Ltd, Bangalore, Inde). L'ADNr 26S partiel a été séquencé et la séquence transcrite interne (ITS) 1, 5.8S, ITS2, y compris le domaine (D) 1, les régions D2 de la grande sous-unité (LSU) ont été complétées. Les séquences d'ADNr 26S ont été multipliées à l'aide des amorces universelles ITS1 (5′TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′) et ITS4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) par un thermocycleur PCR (Mycycler, Allemagne). Le produit de PCR a ensuite été purifié en utilisant le kit de nettoyage PCR SV (GeneAll ExpinTM, Corée). La concentration d'ADN a été mesurée par un équipement nanodrop (Colibri 75173, Allemagne) et les séquences ont été analysées par une machine de séquençage Sanger (Allemagne). La séquence du gène d'ADNr 26S a été comparée à des séquences de levure apparentées à l'aide de NCBI Mega BLAST pour leur identification par paires. La nouvelle séquence a été enregistrée auprès de GenBank (NCBI). Le logiciel CLUSTAL-W a été utilisé pour aligner les multiples alignements de ces séquences. La méthode de jointure voisine a été utilisée pour construire l'arbre phylogénétique à l'aide du logiciel Tree View X21.

Les isolats ont été cultivés dans un volume de travail de 100 ml de milieu ZMA additionné de différentes concentrations de NaCl, notamment 2, 3, 5, 7, 10 et 12 % avec une concentration d'inoculation initiale similaire (OD600 nm = 0,3). La culture a été réalisée dans un incubateur rotatif à 30°C pendant 48h. La croissance de la biomasse a été observée en mesurant la densité optique à la longueur d'onde de 600 nm à différentes périodes de 0, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 et 48 h après la culture. Le milieu ZMA pur a été utilisé comme témoin.

Une fois la culture terminée, 50 ml de milieu de culture ont été centrifugés à 7 000 tr/min pendant 10 min à 4 ° C pour obtenir un culot de biomasse. Le surnageant a été retiré et le culot de biomasse a été lavé deux fois avec de l'eau distillée et séché dans un four à air chaud à 55 ° C, puis pesé sur une balance pour mesurer le poids séché de la biomasse (m1). Le reste du milieu de culture a été centrifugé pour l'extraction de PHA. Les culots cellulaires ont été dissous dans une solution de NaClO à 5 % et incubés à 37 °C pendant 1 h. Ensuite, 50 ml de chloroforme ont été ajoutés et la solution a été incubée à 37 ° C pendant encore 1 h. Ensuite, la solution a été centrifugée pour éliminer la phase supérieure. La phase inférieure contenant les PHA a ensuite été diluée dans du chloroforme et additionnée d'un volume similaire de mélange de méthanol glacé (rapport 9:1) (v/v) pour la précipitation des PHA. Ensuite, la solution contenant les PHA précipités a été vortexée pendant 2 min et centrifugée à 10 000 tr/min pendant 10 min. Le surnageant a été éliminé et le culot de PHA a été séché à 40°C. Le poids de PHA purifié a été mesuré (m2). La teneur en PHA a été calculée à l'aide de la formule suivante :

Les groupes fonctionnels présents dans le PHA extrait ont été évalués à l'aide d'un spectromètre Spectrum Two FT-IR (PerkinElmer, Angleterre). En bref, 1 mg de PHA a été dilué dans 7 ml de chloroforme et 1 goutte du mélange a été déposée sur un disque FTIR KBr. La fréquence du spectre infrarouge (IR) a été lue dans une plage de 400 à 4000 cm-1 à une résolution spectrale de 4 cm-1 sous vide22.

La structure chimique du composé extrait produit par l'isolat a été identifiée à l'aide d'une analyse spectroscopique RMN du proton. L'échantillon a été préparé en dissolvant le PHA extrait (6 mg) dans 0,5 ml de chloroforme deutéré (CDC13). Les spectres RMN 1H et RMN 13C ont été enregistrés à 125 et 400 MHz à l'aide d'un spectrophotomètre RMN Bruker Advance III (Harwell, Angleterre). La température de la sonde (25 °C) et le tétraméthylsilane comme étalon interne ont été utilisés pour cette étude23.

Le système d'analyse se compose d'un chromatographe en phase gazeuse GC 8000 (Fisons Instruments, Mayence, Allemagne) équipé d'une colonne DB5 ms de 30 m (film de 0,25 mm sur 0,33 μm ; J&W Scientific, États-Unis) et d'un détecteur sélectif de masse MD 800 (Fisons Instruments) fonctionnant à 70 eV ou d'un spectromètre de masse triple quadripôle TSQ 700 (Finnigan Corp., San Jose, Californie) fonctionnant dans un seul quadripôle (Q1). Un programme de température de 60 à 290 °C (10 °C/min) a été appliqué pour séparer les fragments de structure sur la colonne24.

La pureté du PHA a été déterminée en utilisant la méthode de l'acide crotonique25,26. En bref, 5 mg de mélange extrait de PHA ont été ajoutés dans 10 ml de H2SO4 concentré, puis bouillis à 100 ° C pendant 30 min pour convertir le PHA en acide crotonique. La courbe d'étalonnage standard de l'acide crotonique a été construite en utilisant un standard de PHA pur acheté chez Sigma. La quantité de PHA dans le mélange d'extraction a été déterminée en comparant la quantité d'acide crotonique produite à celles de la courbe d'étalonnage standard. Un témoin négatif a également été employé en utilisant une solution de H2SO4 sans addition de PHA. La pureté du PHA a été calculée comme le pourcentage de PHA dérivé de la levure par rapport à la courbe d'étalonnage de l'étalon de 5 mg de PHA27.

Divers facteurs d'influence, notamment la température (15, 20, 25, 30, 35 et 40 °C), les valeurs de pH (4, 5, 6, 7, 8 et 9), les sources de carbone (glucose, mannitose, lactose, amidon, saccharose), les sources d'azote (peptone, extrait de levure, sulfate d'ammonium, chlorure d'ammonium, nitrate d'ammonium, urée) ont été optimisés pour obtenir les conditions optimales pour la croissance des levures et la production de PHA. Les effets de la limitation de l'azote sur la production de PHA par la levure marine à l'aide des sources de carbone et d'azote criblées ont également été étudiés. Différents rapports carbone/azote (C:N, poids/poids) dans la plage de 10:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1 et 80:1 ont été étudiés pour identifier le rapport C:N optimal. Toutes les expériences de culture ont été menées dans des flacons Erlenmeyer de 250 ml avec un volume de fonctionnement de 100 ml pendant 72 h à 30 ° C sous incubateur rotatif. La teneur maximale en PHA (%) et la concentration en PHA (gL-1) produites par la souche de levure ont été atteintes sur la base du poids sec total des cellules (gL-1). De plus, la culture de la levure a été réalisée à différents volumes de fonctionnement, notamment 200, 500, 1000, 2000 et 5000 ml pour obtenir un volume approprié pour la production de PHA.

Le film de PHA a été formé en dissolvant le PHA obtenu dans du chloroforme additionné de 4 % de PEG (pour réduire la dureté du film) puis la solution a été versée dans des boîtes de Pétri de 9,8 mm de diamètre. Les boîtes de Pétri ont été laissées dans la hotte pour permettre l'évaporation du solvant pour former un film de PHA. Le film de PHA d'une épaisseur de 0,035 mm, d'une surface de 75,4 mm2, d'un poids de 1 g/L a ensuite été incubé dans un milieu contenant 5 g/L de glucose, 1 g/L d'extrait de levure et de l'eau de mer (3 % NaCl) dans des flacons. Trois groupes ont été soumis à cette expérience, dont un groupe témoin utilisant de l'eau de mer stérilisée, un groupe utilisant de l'eau de mer naturelle (pour observer la bio-atténuation du consortium de micro-organismes naturels dans l'eau de mer) et un groupe utilisant de l'eau de mer stérilisée additionnée de Pichia sp. lui-même avec la concentration d'inoculation initiale de 0,5 %. Les flacons des 3 groupes ont été incubés pendant un total de 28 jours à 30 ° C et 200 tr/min pour étudier la biodégradabilité des films de PHA. Les films de PHA ont été pesés par gravimétrie au début et après 28 jours. La structure des films avant et après décomposition a été analysée en utilisant la microscopie électronique à balayage (MEB).

Le MEB a été utilisé pour observer la topologie de surface des films de PHA. Les films ont été placés sur des porte-échantillons (recouverts de bandes de carbone), puis placés dans le système SEM JEOL JSM6400 et analysés conformément aux manuels du fabricant22.

Toutes les expériences ont été menées en triple (n = 3). L'analyse statistique des résultats a été réalisée à l'aide du progiciel standard de Microsoft Excel. Les résultats ont été représentés sous forme de moyenne avec écart type (moyenne ± ET). La signification entre les moyennes testées à l'aide du test t de Student était de p < 0,05.

Les micro-organismes étaient considérés comme des usines cellulaires pour la production de polyhydroxyalcanoates28. À partir d'échantillons de sédiments collectés, une souche de levure halophile nommée TSLS24 a été isolée à l'aide du milieu ZMA. En utilisant la coloration au rouge du Nil et en observant sous microscopie à fluorescence, la souche TSLS24 présentait une fluorescence orange, il pourrait donc s'agir d'un organisme producteur de PHA (Fig. 1a). La morphologie de la souche de levure TSLS24 était ivoire, les colonies portant une marge entière, de forme circulaire, convexe, une surface légèrement rugueuse avec une taille de colonie d'environ 2 à 3,5 mm de diamètre. La souche n'excrète aucun pigment dans le milieu de culture. Les cellules TSLS24 sont de forme ovale allongée et possèdent un seul pôle en bourgeonnement. La cellule mesure environ 4,0–10,0 × 2,5–5,5 µm.

(a), levures productrices de PHA TSLS24 en microscopie à fluorescence ; (b), arbre phylogénétique construit par la méthode de jonction voisine basée sur le domaine D1/D2 des séquences de gènes d'ARNr 26S (LSU) d'espèces proches, par le logiciel MEGA-X avec analyse de jonction voisine, indique la position des isolats G1-4(1) et G1-12(3). La valeur des bootstraps (%) était basée sur 1 000 réplications.

La séquence du gène d'ADNr 26S de TSLS24 liée à celles des séquences de levure voisines a été réalisée en utilisant NCBI Mega BLAST pour son identification par paires. L'analyse phylogénétique a été évaluée sur la base de la séquence partielle de l'ADNr 26S et de la séquence complète du gène de l'ARN ribosomal ITS 1, 5.8S, de l'ITS 2 et de l'ARN ribosomal LSU de TSLS24. Ces résultats ont confirmé que le génome de TSLS24 correspond le plus au genre Pichia kudriavzevii avec une unicité importante (100 %), similaire à un genre Pichia kudriavzevii Y-5396 T précédemment enregistré (GenBank : EF550222). L'isolat a été nommé Pichia kudriavzevii TSLS24 et enregistré dans GenBank avec le numéro d'identité OL757724. Le logiciel CLUSTAL-W a été utilisé pour affilier plusieurs alignements de ces séquences et l'arbre phylogénétique a été insinué à l'aide de la méthode de jonction de voisins (Fig. 1b). La morphologie de TSLS24 est analogue à celle de P. kudriavzevii HOP-1, qui a été décrite comme étant de couleur blanchâtre à crémeuse avec une surface surélevée et une taille ovale, ellipsoïdale à allongée sous SEM29. Plusieurs espèces de levures ont été affirmées avoir la capacité de produire des PHA telles que Candida bombicola30, Candida tropicalis BPU131, etc. Cependant, très peu de Pichia sp. a été signalé comme un bon producteur de PHA19. Pichia kudriavzevii VIT-NN02, isolée de la mangrove marine à 24 Parganas, dans les Sundarban indiens, où la salinité augmente de 30 % tout au long de l'année, a été reconnue comme un producteur potentiel de PHA19. Pichia kudriavzevii a également été trouvée comme levure productrice de bioéthanol pouvant être utilisée pour la fermentation à l'échelle pilote32).

Pour évaluer la tolérance saline du TSLS24, une gamme de concentrations de NaCl comprenant 2, 3, 5, 7, 10 et 12 % a été établie. Selon Quillaguamán et al.33 et Kourmentza et al.34, les souches tolérantes au sel ou halophiles pourraient être utilisées pour obtenir du PHA par choc hypo-osmotique au lieu d'utiliser des solvants. Il est considéré que les micro-organismes halophiles pourraient être utilisés comme biocatalyseurs pour la production industrielle de PHA33,34. Les résultats ont montré que la culture de Pichia sp. TSLS24 dans un milieu ZMA additionné de 7 % de NaCl a atteint la concentration de biomasse optimale de DO600 de 2,2 ± 0,2 après culture pendant 48 h (DO600 initiale nm = 0,3), égale à 1,15 ± 0,14 (g/L). D'autre part, la culture avec 10 % de NaCl a donné une DO600 de 1,5 ± 0,2, égale à 0,88 ± 0,06 (g/L). Il n'y a pas de croissance de levure inoculée dans un milieu additionné de 12 % de NaCl. Par conséquent, l'isolat a été déterminé comme une levure halophile qui peut tolérer une concentration de NaCl jusqu'à 10 %. Plusieurs souches bactériennes halophiles ont été signalées comme productrices de PHA, notamment Halomonas sp.35, Haloferax mediterranei8, Alsafadi et al.9, Halogeometricum borinquense36 et d'autres. Cependant, les études sur les souches de P. kudriavzevii productrices de PHA halophiles sont limitées. Les résultats obtenus fournissent donc plus d'informations sur la production de PHA à partir de Pichia.

Le PHA extrait de Pichia sp. Le TSLS24 a été analysé par FT-IR par rapport au standard PHA (Sigma). Les spectres présentés sur les Fig. 2a, b ont révélé que la bande d'absorption apparaissait à 3441 cm-1 représentant la flexion O – H. La nature large et la valeur inférieure de la fréquence indiquent que l'OH est lié à l'hydrogène libre. Les pics proéminents à 2854 cm−1 et 2934 cm−1 montraient des groupes influents d'étirement –CH2 et –CH3 d'alcanes. Le pic de 1720 cm-1 était le groupe d'allongement C = O du groupe ester dans le PHA. Le groupe –CH(CH2)2– a été présenté au sommet de 1379 cm−1. Des liaisons d'étirement alcane (C – H) ont été observées à 1278 cm-1. Deux fortes liaisons d'étirement C–O se sont produites à 1100 cm−1. Un résultat similaire a été rapporté par Ojha et Das19, où une analyse FTIR des PHA de Bacillus tels que B. cereus, B. mycoides et B. thuringiensis et d'un autre Pichia kudriavzevii VIT-NN02 a été présentée.

(a), spectromètre FTIR de norme PHA ; (b), PHA produit par Pichia sp. TSLS24 ; (c), analyse HNMR de l'étalon PHA (Sigma); (d) PHA produit par Pichia sp. TSLS24 ; (e), analyse GC-MSn de l'étalon PHA (Sigma); (f) PHA produit par Pichia sp. TSLS24 ; (g), spectres de masse du PHA accumulé par TSLS24 ; (h), ligne standard Crotonic pour la mesure de PHA.

La structure monomère du composé extrait par Pichia sp. TSLS24 a été révélé par les spectres RMN 1H et 13C, comme illustré sur les figures 2c, d. Le signal à 1,2 ppm était lié au solvant, CDC137. Les pics existant à 2,4 et 2,5 ppm correspondaient au groupe méthylène (–CH–(CH2)–CO–) le plus proche d'un atome de carbone asymétrique avec 1 proton. Le spectre RMN 1H présentait des signaux des protons du méthane (–CH–) à 5,2 ppm signifiant la liaison –O–(CH–) CH2– au carbone numéro 3. Cependant, le PHA extrait a plusieurs pics minuscules à 1,9 et 4,1 ppm.

Selon l'analyse GC – MS, le PHA accumulé par TSLS24 a le même temps de rétention que le PHA standard acheté à 28,3 min (Fig. 2e, f). Dans la Fig. 2g, les spectres de masse indiquaient un ion pic de base à m/z 279 avec des ions fragments à m/z 167 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C(O)] ; 149 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C–] et 113 [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–C–]. En fait, le fragment [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C(O)] était de 172 ; [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–CH(CH3)–CH2C–] était de 156 et [–O–CH(CH3)–CH2C(O)–O–C–] était de 114 mais la chromatographie n'a que le m/z de 167, 149 et 113. On pourrait expliquer que pendant l'analyse, plusieurs ions H+ dans les groupes méthyle ont disparu. Le type de PHA produit par P. kudriavzevii. Le TSLS24 par analyses FT-IR, RMN et GC s'est avéré être un homopolymère de poly (3-hydroxybutyrate) (PHB) standard.

Selon Law et Slepecky25 et Lee et al.26, le PHA a été complété par du H2SO4 concentré puis bouilli à 100 °C pendant 30 min pour convertir le PHA en acide crotonique. Par conséquent, dans cette étude, le PHA commercial a été utilisé comme standard interne/contrôle positif et la lignée standard d'acide crotonique a été construite. Selon la ligne standard d'acide crotonique (Fig. 2h), la concentration de PHA produite par P. kudriavzevii TSLS24 a été estimée à 4, 57 ± 0, 35 mg sur un échantillon de 5, 0 mg (p / p). Ce résultat indique que la pureté du PHA extrait est de 91,38 % par rapport à l'étalon.

La production de PHA dans les microbes est un processus complexe, qui est affecté par des facteurs nutritionnels et environnementaux, notamment la température, le pH, la source de carbone, la source d'azote et le rapport C/N. Par conséquent, il est nécessaire d'optimiser ces paramètres d'influence pour maximiser la production de PHA à partir de la souche isolée.

Le Pichia sp. TSLS24 a été cultivé dans du milieu ZMA à différentes températures pendant 96 h. Le tableau 1 a montré que TSLS24 pouvait bien se développer et produire du PHA dans une large plage de températures allant de 15 à 45 °C. Cependant, à l'extrémité supérieure de la plage de températures de 40 à 45 ° C, la teneur en PHA n'a atteint que 24,3 à 26,2 % de la biomasse séchée ; les concentrations de biomasse étaient de 2,84 et 2,18 gL-1 et les concentrations de PHA étaient de 0,74 et 0,52 gL-1, respectivement. La température inférieure à 15 ° C, les concentrations de biomasse et de PHA étaient de 2, 55 et 0, 76 gL-1. Une plage de température plus optimale pour la production de PHA est de 20 à 35 ° C où la teneur et la concentration en PHA étaient supérieures à 40% et 1,12 gL-1. Avec la température de culture la plus optimale allant de 30 à 35 °C, la concentration de biomasse obtenue était supérieure à 3 gL-1 avec une teneur en PHA d'environ 47 %. La teneur et la concentration en PHA ont atteint un maximum de 47,5 % et 1,65 gL-1 à une température de culture optimale de 35 °C. Ces résultats étaient en accord avec d'autres souches de levure productrices de PHA Ojha et Das19. En outre, la large gamme de températures viables, en particulier l'extrémité supérieure de 40 à 45 ° C, ainsi que la plage de températures optimales étaient conformes aux études publiées sur la productivité d'autres composés dans la levure, tels que le Pichia kudriavzevii HOP-1, tolérant à la chaleur, qui aurait été capable de produire de l'éthanol avec une bonne efficacité à 40–45 ° C29,37. En conséquence, une température de culture de 35 ° C a été sélectionnée pour une expérience ultérieure.

Les expériences ont été menées avec un pH moyen initial de 4, 5, 6, 7, 8 et 9 de la même manière que celles avec une température dont les résultats ont été présentés dans le tableau 2. La biomasse obtenue a montré que TSLS24 pouvait croître dans toutes les valeurs de pH. Les concentrations en biomasse des cultures aux pH 4 et 5 étaient de 0,98 et 1,26 gL-1 ; les concentrations en PHA étaient de 0,12 et 0,35 gL-1 ; également à 12,2 et 27,8 % de la teneur en PHA, respectivement. Avec la gamme de pH 6–9, l'accumulation de PHA dans Pichia sp. Le TSLS24 était élevé et la valeur optimale pour la production de PHA est de pH 7. À pH 7, la production de biomasse était la plus élevée (2,78 ± 0,17 gL-1) et la teneur en PHA atteignait le maximum de 46,5 %, ce qui permettait à la concentration de PHA d'atteindre le maximum de 1,28 ± 0,20 gL-1. Pour des valeurs de pH légèrement alcalines de 8 et 9, la teneur en PHA s'est maintenue dans la plage de 45,8 à 46,4%, bien que la concentration de biomasse ait commencé à diminuer suite à l'augmentation des valeurs de pH, en détail les concentrations de biomasse étaient de 2,24 et 1,84 gL-1 et les concentrations de PHA étaient de 1,02 et 0,84 gL-1.

Selon d'autres littératures, Pichia sp. était normalement utilisé dans la fermentation du vin et de la bière avec un pH de 3 à 429. Par ailleurs, Pichia sp. est un genre de levure précieux pour créer une saveur et un arôme pour les fèves de cacao à pH 429. Dans la recherche sur la production de PHA, il a été démontré que la production de PHA était significativement réduite à un pH acide plus bas par rapport à un pH alcalin plus élevé, où elle était stable19,38. Notre observation dans la présente étude a montré que Pichia sp. TSLS24 pourrait également bien se développer dans des plages de pH plus élevées de 6 à 9 et avoir une productivité élevée de PHA et le pH optimal était de 7. Des résultats similaires ont été publiés pour Alcaligenes latus qui a atteint une production de PHB de 10, 30 ± 1, 01 gL-1 avec le pH optimal plages de 6, 0 à 7, 539. Selon le résultat de l'optimisation, un pH de 7 a été déployé pour les expériences ultérieures.

Les microbes peuvent utiliser différentes sources de carbone pour leur croissance et leur synthèse de précurseurs de PHA. Ces précurseurs pourraient être davantage polymérisés en PHA en fonction des voies métaboliques. Des microbes tels que Pseudomonas sp., Halomonas sp et Cupravidus sp. ont été signalés comme étant les meilleures souches pour la production de PHA en utilisant des sucres à six carbones, par exemple le glucose, la cellulose, le fructose, le mannose, le galactose et le maltose sur la base de la voie de la glycolyse5,6. Il a également été signalé que le lactose était utilisé dans la production de PHA et de biohydrogène par une fermentation en deux étapes de lactosérum de fromage déprotéinisé, dans laquelle le lactose est l'un des principaux constituants40. Les sucres à cinq carbones peuvent également être utilisés par la voie des pentoses phosphates, cependant, seuls quelques microbes pourraient convertir efficacement ces sucres en PHA, car la plupart des souches productrices de PHA qui préféraient les sucres à 6 carbones ont de faibles activités métaboliques des sucres à 5 carbones41. Dans un cas rare, il a été rapporté que Burkholderia sacchari DSM 17165 était capable de produire efficacement du PHA avec du xylose et de l'arabinose comme sources de carbone41. Par conséquent, dans la présente étude, 20 gL-1 de sucres à six carbones, dont le glucose, le mannitose, le lactose, l'amidon ou le saccharose, ont été utilisés comme source de carbone dans le milieu ZMA avec un pH de culture et une température de pH 7 et 35 ° C.

Le tableau 3 a démontré que toutes les sources de carbone étudiées conviennent à la croissance des levures et à la production de PHA. Parmi eux, le glucose est la meilleure source de carbone pour la production de PHA avec une concentration et une teneur en PHA de 1,43 ± 0,07 gL-1 et 50,5 %. Les autres sources de carbone telles que le lactose, le saccharose, l'amidon et le mannitose ont amené la quantité de biomasse à 2,66, 2,42, 2,19 et 2,55 gL-1 ; et PHA à 1,26, 1,08, 0,97 et 0,99 gL-1, respectivement. La flexibilité de TSLS24 dans l'utilisation de différentes sources de carbone est conforme aux études précédentes. P. kudriavzevii a été signalé comme une levure pouvant utiliser de manière flexible diverses sources de carbone, telles que le glucose, le saccharose, le galactose, le fructose et le mannose29. De plus, il a été rapporté que la levure marine P. kudriavzevii VIT-NN02 était capable d'utiliser efficacement les déchets de peaux de banane comme source de carbone pour la production de PHA et a atteint une teneur en PHA de 79 %19. De plus, des sources de carbone bon marché, notamment de la mélasse de canne à sucre, de l'huile de palme et de la liqueur de maïs, ont été utilisées par la levure Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 isolée du jus de canne à sucre pour produire du PHA avec un rendement en PHA de 19,05 ± 0,3 gL-1 obtenu après 96 h de culture38.

En général, l'azote est un nutriment crucial pour la croissance de tout microbe. La synthèse de PHA dans les microbes est sensible à l'azote, et la plupart des souches productrices de PHA ont des préférences différentes en matière de source d'azote. tels que l'ammoniac, l'urée et le nitrate42. Par conséquent, la sélection des sources et des concentrations d'azote est très importante pour la croissance des micro-organismes et la production de PHA. Dans la présente étude, la culture de P. kudriavzevii TSLS24 a été examinée avec différentes sources d'azote, y compris des sources organiques et inorganiques (tableau 4).

Parmi les sources d'azote criblées, l'extrait de levure s'est avéré être la source d'azote la plus appropriée pour la production de PHA par P. kudriavzevii TSLS24 (teneur en PHA de 55,2 %), suivi de la peptone (54,6 %), du sulfate d'ammonium (NH4)2SO4 (31,6 %), du nitrate d'ammonium (NH4NO3) (26,1 %), du chlorure d'ammonium (NH4Cl) (24,9 %) et de l'urée (18,5 %). Sur la base des résultats, la culture de TSLS24 avec des sources organiques telles que la peptone et l'extrait de levure a donné une production de biomasse (2,66–2,70 gL−1) et une teneur en PHA (54,6–55,2%) plus élevées par rapport aux sources d'azote inorganique (0,24–1,42 gL−1 et 18,5–31,6%). Des sources d'azote organique ont également été utilisées pour la culture de Pichia sp. Comme indiqué par Ojha et Das19,38, la liqueur de maïs et l'hydrolysat de plumes de poulet ont été utilisés comme source d'azote bon marché pour la culture de Wickerhamomyces anomalus VIT-NN01 et Pichia kudriavzevii VIT-NN02, respectivement pour la production de PHA. Ces résultats suggèrent qu'il pourrait être intéressant d'examiner la production de PHA à partir de Pichia sp. TSLS24 utilisant des sources d'azote organique peu coûteuses telles que la liqueur de maïs, le son de blé, la plume de poulet et autres.

Il a été démontré que le rapport C:N affecte la croissance des levures et la production de PHA19. La raison en est que lorsque la source de carbone dans le milieu de culture est en excès alors que l'un des autres facteurs nutritionnels, par exemple N, S, P, est limité, la levure serait stimulée pour produire du PHA sous la forme de granules de stockage de carbone à l'intérieur de la cellule. Dans un état déficient en azote, les microbes ont tendance à réduire les activités de production de protéines microbiennes, ainsi qu'une synthèse accrue de PHA à stocker en tant que source d'énergie de réserve majeure43,44. Par conséquent, dans cette recherche, l'effet du rapport C: N sur la production de PHA par P. kudriavzevii TSLS24 a été évalué avec du glucose et des extraits de levure ont été utilisés comme sources de carbone et d'azote. La concentration de glucose a été fixée mais les concentrations d'extrait de levure ont été modifiées.

Le tableau 5 a démontré que 20: 1 était le rapport C: N le plus efficace pour la croissance cellulaire et la production de PHA, atteignant une teneur et une concentration en PHA de 50, 9% et 1, 53 ± 0, 11 gL-1. Cependant, il n'y a pas de différence significative entre tous les ratios examinés. Les résultats de la présente étude étaient conformes à ceux de Wang et al.44, dans lesquels une réduction de la teneur en PHA dans la biomasse a été signalée dans des conditions riches en azote. En général, la préférence du rapport C/N varie avec le type de souche, de carbone et de source d'azote. Différents rapports C/N optimaux ont été rapportés pour la production de PHA chez divers microbes, tels que 40 :1 pour Pseudomonas mendocina45, 21 :1 pour Alcaligenes denitrifcans A4146 et 15 :1 pour Bacillus megaterium47. Le rapport C/N de 20:1 a également été signalé comme étant optimal pour l'accumulation de poly-3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate jusqu'à 67 % en poids dans Ralstonia eutropha en utilisant l'huile usée de café comme source de carbone et le chlorure d'ammonium comme source d'azote48. Chez Haloferax mediterranei, il a été rapporté que le rapport C/N pourrait affecter la capacité de production simultanée de PHA et d'exopolysaccharides (EPS) où l'ajustement du rapport C/N affecte la proportion de PHA et d'EPS synthétisés. À un rapport C/N supérieur de 30, le PHA était le produit principal, tandis qu'à un rapport C/N inférieur de 10, l'EPS était principalement produit38. Le rapport C/N de 20:1 a été sélectionné pour une expérience ultérieure (fichier supplémentaire 1).

Pichia kudriavzevii TSLS24 a été cultivée dans des conditions optimales de pH 7, 35 °C avec 20 g/L de glucose et 1 g/L d'extrait de levure. La fermentation a été conduite avec différents volumes opératoires de 200, 500, 1000, 2000 et 5000 ml pendant 10 jours. Après toutes les 3 h de culture, 10 gL-1 de glucose ont été complétés pour fournir une redondance de glucose et assurer une limitation en azote qui a stimulé la souche à produire du PHA.

D'après le tableau 6, on peut observer que la teneur et la concentration en PHA se maintiennent dans la plage de 46,3 à 52,9 % et de 1,72 à 1,84 gL-1 quel que soit le volume de fermentation. Lorsque le volume de fermentation a atteint 5000 mL, la production de PHA a atteint 1,79 gL-1 avec une concentration de biomasse de 3,42 gL-1, atteignant une teneur en PHA jusqu'à 52,9 %. Par conséquent, P. kudriavzevii TSLS24 pourrait être plus adapté à une fermentation à plus grande échelle, par exemple à l'échelle pilote qu'à l'échelle du laboratoire.

Récemment, il existe un certain nombre de rapports sur les micro-organismes producteurs de PHA tels que Bacillus, Clostridium, Mycobacterium, Streptomyces, Fusobacterium, Burkholderia, Pseudomonas, Bordetella, Neisseria, Agrobacterium, Rhizobium, Ralstonia, Vibrio, Legionella, Acinetobacter, Sphingomonas, Rickettsia48,49,50. Les souches de levure génétiquement modifiées telles que Kloeckera sp., S. cerevisiae, Y. lipolytica, P. pastoris et la souche Rhodotorula minuta RY4 ont également été signalées comme productrices de PHA11,13,15,16. En 2018, Ojha et Das ont exploré une souche de levure potentielle Wickerhamomyces anomalus isolée à partir de sources naturelles. Bien que les informations sur la levure productrice de PHA halophile soient limitées, la levure est une option potentielle pour la production de PHA à l'échelle pilote28.

L'étude de la biodégradation est cruciale pour comprendre le taux de dégradation des matériaux plastiques et les mécanismes impliqués. Les résultats de l'étude de dégradation ont montré qu'après 28 jours, le poids du film PHA dans le groupe témoin (sans micro-organismes) n'a pas changé, tandis que le poids a été réduit de 28 % et de 19,5 % dans le groupe expérimental inoculé avec TSLS24 et le groupe utilisant de l'eau de mer naturelle non purifiée. Les structures des films de PHA ont été observées et analysées au MEB (Fig. 3). Les structures du film PHA inoculé avec TSLS24 ont subi des changements significatifs où les liaisons entre les molécules ont été rompues par le TSLS24 (Fig. 3d), tandis que la structure du contrôle sans microbe était stable (Fig. 3b) et la structure du film PHA complété avec de l'eau de mer naturelle a été légèrement perturbée (Fig. 3c). Le film de PHA extrait a également été dégradé dans l'eau de mer sous forme de bio-atténuation. Les résultats suggèrent que le PHA produit par la souche TSLS24 pourrait être facilement dégradé en milieu salin (eau de mer) par les microbes naturels présents dans l'environnement. Comparée à la dégradation dans le sol et le compost, la dégradation des plastiques dans l'eau de mer est plus complexe en raison de la basse température, de la salinité élevée, de la haute pression, des courants et des faibles niveaux de nutriments (par exemple, les nitrates) de l'environnement marin, sans parler de la variation entre les différentes saisons, les différentes régions ou la profondeur/pression dans le sens vertical affectant au moins la température de l'eau. Par conséquent, des enquêtes et des évaluations approfondies sont nécessaires pour fournir une base cruciale avant toute autre application pratique.

(a), échantillon de PHA produit par Pichia sp. TSLS24 ; Changements dans la structure des membranes de PHA après 28 jours sous TEM, grossissement de 2000X : (b) Échantillon de PHA témoin intact incubé dans de l'eau de mer stérile sans microbes ; (c) Échantillon de PHA dégradé par des microbes naturels dans de l'eau de mer non stérile ; ( d ) Échantillon de PHA dégradé par Pichia sp. TSLS24 dans de l'eau de mer stérilisée.

Depuis 1992, la dégradation des PHA dans l'eau de mer a été rapportée dans certaines études phares44,51. Le mécanisme de dégradation des PHA dans l'eau de mer a suivi l'érosion de surface, comme cela a également été signalé dans le sol et le compost. Cependant, le taux de dégradation des PHA dans l'eau de mer était significativement plus lent. Le taux de dégradation moyen du PHA dans l'océan a été déterminé comme étant de 0,04 à 0,09 mg jour-1 cm-2 où l'épaisseur et la forme géométrique du produit pourraient affecter le temps requis pour la dégradation. Pour les sacs en plastique de 0,035 mm d'épaisseur, le temps de dégradation complète était compris entre 25 jours et 2 mois, alors qu'une bouteille en plastique de 0,8 mm d'épaisseur ne pouvait être complètement dégradée qu'après au moins 1,5 an1.

Dans la présente étude, une souche de levure halophile Pichia sp. Le TSLS24 isolé de l'île de Spratly au Vietnam a montré sa capacité à se développer et à produire efficacement du PHA dans une large plage de températures de 15 à 45 ° C, une large plage de pH de pH 6 à 9, des sources de carbone flexibles telles que le glucose, le mannitose, le lactose, l'amidon et le saccharose ainsi que différentes sources d'azote. L'efficacité de la production de PHA à différents volumes de fermentation était stable et a atteint une teneur élevée en PHA de 52 %. Le PHA extrait était homologue avec une pureté élevée (91, 4%) et il a été confirmé comme PHB acheté en utilisant des analyses FTIR, RMN et GC – MS. et le PHA accumulé peut être facilement biodégradé par les organismes naturels, même dans des conditions extrêmes comme dans l'eau de mer. Les travaux futurs incluent l'optimisation de l'extraction et de la production de PHA à l'échelle pilote ou in vivo. Les résultats donnent un aperçu de la production de PHA par P. kudriavzevii TSLS24. En particulier, le TSLS24 pourrait être utilisé pour produire du PHA dans un environnement insulaire et le PHA pourrait être utilisé pour remplacer d'autres matériaux plastiques.

Les ensembles de données générés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le référentiel OL757724, lien : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OL757724.

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Ce travail a été financé par le projet de l'Académie des sciences et technologies militaires en 2021 : "Étude sur la production de bioplastiques biodégradables dans des conditions marines et insulaires".

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Nguyen Viet-Linh et Le Thi Nhi-Cong.

Institut des nouvelles technologies, Académie des sciences et technologies militaires, Hanoï, 10072, Vietnam

Nguyen Thi Tam Thu, Le Huy Hoang & Pham Kien Cuong

Institut de biotechnologie, Académie vietnamienne des sciences et de la technologie, 18 Hoang Quoc Viet, CauGiay, Hanoï, 10072, Vietnam

Nguyen Viet-Linh & Le Thi Nhi-Cong

Université supérieure des sciences et technologies, Académie des sciences et technologies du Vietnam, Hanoï, 10072, Vietnam

Nguyen Viet-Linh & Le Thi Nhi-Cong

Université des sciences, Université nationale du Vietnam-Hanoi, Hanoi, 11400, Vietnam

Tran Thi Huyen Nga

Institut de technologie environnementale, Académie des sciences et technologies du Vietnam, Hanoï, 10072, Vietnam

Dang Dinh Kim

Département de génie chimique et des matériaux, Université Tunghai, Taichung, 407224, Taïwan

Yoong Kit Leong

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NTTT : Conceptualisation, Acquisition de financement, Administration de projet. LHH : Méthodologie, Curation des données, PKC : Enquête de visualisation, Rédaction Préparation du projet original NV-.L. : Logiciel, Validation, Rédaction - Révision et édition TTHN : Enquête de visualisation, Méthodologie, DDK : Curation des données, Validation YKL : Révision et édition LTN-.C. : Conceptualisation, Rédaction - Révision et édition.

Correspondance à Nguyen Viet-Linh ou Le Thi Nhi-Cong.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Thu, NTT, Hoang, LH, Cuong, PK et al. Évaluation de la synthèse de polyhydroxyalcanoate (PHA) par Pichia sp. Levure TSLS24 isolée au Vietnam. Sci Rep 13, 3137 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28220-z

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Reçu : 08 septembre 2022

Accepté : 16 janvier 2023

Publié: 23 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-28220-z

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